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植物线粒体是重要的植物细胞器，负责ATP的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。而对植物线粒体进行遗传研究需要进行线粒体DNA纯化。

• 提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的PCR级别的线粒体DNA提取。
  
• 精提利用冷冻超速离心（离心力达40000×g）制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的测序级别的线粒体DNA提取。

本试剂盒足够5次提取，每次可处理10g绿色植物组织（可得1～2.5mg左右线粒体）或20g非绿色植物组织（可得2～5mg左右的线粒体）。

线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。

1. 植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：
   

   植物组织种类	线粒体产率	说明
   根和块茎	0.3mg/10g	如土豆，红薯等
   黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘）	2～5mg/10g	多酚含量低于叶片
   有光合作用的叶片和子叶	1～2.5mg/10g	需放置在暗处3天

2. 一般纯化最好选用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
   
3. 一次实验需要10g绿色植物组织（或20g干净的非绿色植物组织）、40mL植物线粒体提取匀浆液、约90mL植物线粒体提取洗涤液和35mL植物线粒体提取密度梯度离心介质（密度梯度离心介质的配制方式是一次性将9.8g=8.7mL Percoll加入到26.3mL本试剂盒提供的植物线粒体提取离心介质溶液中，充分混匀后得到35mL植物线粒体提取密度梯度离心介质）。上述三种溶液用前均需要加入BSA干粉使其终浓度为0.1%（100mL溶液加0.1g BSA干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA干粉加入，否则容易长菌。

4. 将10g的绿色植物组织（去叶脉后的嫩叶子、愈伤组织）或20g干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10分钟，取出用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL匀浆液（已加0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成1cm2大小的碎片。
   
   • 处理样品量太大，线粒体产率会急剧降低，所以如同一样品太多可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集。
5. 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring匀浆器中，中速匀浆3次，每次15秒，每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀到刀片处。也可使用研磨法，具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3～4分钟。
   
   • 植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5M KOH将pH调到7.0以上才进入下一步。
6. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
   
7. 在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000×g离心5分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL塑料离心管中。
   
8. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12000×g离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
   
9. 加入10mL预冷的植物线粒体提取洗涤液（已加0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
   
10. 将线粒体重悬液转移到新的50mL离心管中，再加入30mL预冷的植物线粒体提取洗涤液，4℃ 1000×g离心5分钟。线粒体将在上清中。
    
11. 将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000×g离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15～30%。
    
12. 在沉淀中加入2mL预冷的植物线粒体提取洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4管线粒体沉淀重悬在2mL植物线粒体提取洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45～75%。
    
13. 在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右的线粒体粗提液到载玻片上，再滴入50μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
    
14. 所得线粒体粗提液含其他细胞器(如类囊体膜，质体，过氧化物酶体，乙醛酸循环体或细菌)污染，但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取。如果需要长期保存，则直接放-80℃保存。如此保存的线粒体DNA完整性在几年内都不会发生变化。

15. 预留50μL线粒体粗提液做对照，在约2mL剩余的线粒体粗提液中加入40μL 25mM自备的MgCl₂，再加入0.2mg DNase A干粉，混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品（如50μL）在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase，再取其中的10μL和10μL预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR（需要用户自己设计引物和自备PCR试剂），如果DNase处理过的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA去除比较干净（达到PCR检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR检测不到细胞核DNA。
    
16. 加入0.32mL预冷的自备0.5M的EDTA溶液和40mL预冷的植物线粒体提取洗涤液。
    
17. 4℃ 1000×g离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000×g离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2mL植物线粒体提取洗涤液中。
    
18. 在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右的线粒体粗提液到载玻片上，再滴入50μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

19. 在50mL预冷的塑料离心管中先后加入35mL预冷的植物线粒体提取密度梯度离心介质（配制方法见第三步，用前需先加0.1% BSA）。
    
20. 将2mL线粒体粗提物重悬液铺在植物线粒体提取密度梯度离心介质上。
    
21. 在超速水平离心机上4℃ 40000×g离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
    
    
22. 用广口吸管（可将1mL蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
    
23. 在15～20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的植物线粒体提取洗涤液。
    
24. 转入50mL塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15000×g离心20分钟，沉淀为线粒体。可以直接进入第25步进行DNA提取。如果暂时不提取DNA，则把线粒体沉淀放-80℃保存。

25. 在线粒体沉淀中加入600μL预热的细胞器DNA提取溶液A，用移液枪充分吹打均匀。
    
26. 再加入150μL 65℃预热的细胞器DNA提取溶液B，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。由于溶液B比较粘稠，可以采取称量方法取用，150μL约等于150～160mg。也可以将1mL枪头剪去一截再吸取。
    
27. 65℃放置5分钟。不能室温放置，否则DNA产量会降低10～20%。
    
28. 加入200μL自备氯仿，涡旋震荡混匀30秒，此时溶液将呈乳白色。
    
29. 14000×g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间层的白膜。
    
30. 加入1倍体积(约750μL)的异丙醇到上清液中，用手上下颠倒30秒混匀。此时一般将有絮状DNA沉淀出现。
    
31. 14000×g室温离心3分钟。此时管底将有微小DNA沉淀，小心弃上清，注意不要丟弃DNA沉淀。
    
32. 在离心管中加1mL 75%乙醇，短暂震荡，14000×g室温离心3分钟，弃上清。
    
33. 重复上述75%乙醇洗涤操作一次。
    
34. 短暂离心，小心吸弃残留的液体（约50μL）。此步不要省略，否则残留的液体（含乙醇）将会影响DNA电泳、酶切很PCR等反应。
    
35. 立即加入50～100μL TE缓冲液或超纯水充分溶解线粒体DNA沉淀。
    
36. 直接取5～10μL电泳检测DNA，再测OD计算浓度和纯度，其余样品放-20℃保存备用。